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北虫草菌种人工分离的研究

发布日期:2013-04-03   来源:   作者:    

l材料与方法
1.1材料试剂与仪器
1.1.1供试菌株
    沈阳棋盘山野生的蛹虫草菌株。
1.1.2培养基
    马铃薯100 g、葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、KH2PO4、0.5g、MgS04 0.25 g、琼脂10 g,加蒸馏水至500 mL,煮沸使琼脂完全融化,高压蒸汽灭菌1210℃,30 min。
1.1.3试剂
  75%酒精,无菌水。
1.1 4主要仪器
    手提式压力蒸汽灭菌锅、分析天平、超净工作台、HPX一9082MBE数显电热培养箱,其他常用玻璃仪器等。
1.2试验方法
1.2.1  不同的组织部位分离方法比较
    (1)子实体分离法
    在超净工作台上将虫草子实体用75%酒精浸泡1 min,无菌水冲洗3次,再用小刀分别切取子实体顶端、中部、根部,然后接种到斜面培养基上,18。C恒温培养15 d。观察不同组织部位对北虫草萌发天数、长势、满管时间的影响。
    (2)孢子分离法
    上述方法洗涤得到的子实体,用小刀切取尖端,悬挂在二三角瓶棉塞下端的不锈钢弯钩上.通过悬挂虫草子实体,使顶端朝下.散落下来的孢子落在培养基上,从而继续生长,并产生白色菌丝。在培养的前期,要保证室温不能过高.因此本试验在培养时,将三角瓶置于充满凉水的盆中,并需要每天换水,维持较低的水温。在18℃恒温培养5 d后.无菌条件下取出子实体尖端,将三角瓶放回,
继续培养10 d。
l.2.2不同的消毒方式比较
    以子实体顶端为例,处理方法见表1。
    接种到斜面培养基上,18℃恒温培养15 d。观察不同消毒方式对北虫草萌发天数、长势、满管时间的影响。
1.2.3继代培养试验
    挑选长势好的分离菌种,接种到玻璃瓶中,将玻璃瓶放人培养室培养。
2结果与分析
2.1组织分离法分离北虫草菌种的研究
2.1.1  不同组织部位对北虫草萌发天数的影响
    通过对同一株北虫草分别切取顶端、中端和根部,采用相同的消毒方式进行除菌。可以看出,在培养的最初阶段,在培养顶端和中端部位的试管中,北虫草两端均有白色菌丝生长.而在培养根部部位的试管中,没有白色菌丝生长(网1)。
2.1.2不同组织部位对北虫草长势的影响
    匍匐型菌丝的有无可作为判定菌种优劣的依据,其量越多,菌种质量越优【3_。随着培养时问的延续,在培养3种不同北虫草部位的试管中,均产生了白色菌丝,长势上并没有出现差异。
2.13不同组织部位对满管时间的影响
    经过若干天的培养,3种不同部位的北虫草菌丝体并未出现明显的满管现象。
2.1_4孢子分离法分离北虫草菌种的研究
    孢子分离法培养前期如图2一A,培养2 d后,培养基上已有少量的菌丝生成(图2一B),培养5 d后,培养基上已经形成了大量的菌丝(图2一C)。此时,在无菌条件下取出子实体,继续培养10 d。
    从萌发时间和长势上看,孢子分离法分离得到的菌株品质更优。
2.2不同消毒方式的影响
2-2.1  不同消毒方式对北虫草萌发天数的影响
    北虫草子实体本身就具有一定的抑菌能力㈣,即便未用酒精进行消毒处理,在菌丝体的两端也有菌丝生成,并且未经过酒精处理的菌丝体(1号、2号)萌发较早、较旺
盛。
2-2-2不同消毒方式对北虫草长势的影响
    未经过酒精处理的2组长势较好,并且有明显的匍匐状菌丝出现。而经过酒精处理过的3组长势一般,其中后2组还有未出现菌丝的情况发生,出现这种状况的原因可能是由于在使用酒精消毒的过程中,浸泡时间过长,使菌丝体活性丧失。
2_2.3  不同消毒方式对北虫草满管时间的影响
    未经过酒精消毒的2组(1号、2号)北虫草菌丝体,在培养8 d后,菌丝体长满了整个试管,而其余几组则没有满管的现象出现。
2.3继代培养验证
    孢子分离法分离得到的菌株,经继代培养得到的虫草子实体(图3),色泽和产量都很好,这验证了孢子分离法分离得到的菌株品质更优这一结论。
图3孢子分离法分离得到的菌株继代培养得到的虫草子实体
3结论与讨论
3.1结论
    通过实验可得出,第一,子实体靠近顶端分离的菌种易于萌发,孢子分离得到的菌种品质更优;第二,北虫草子实体本身就具有抑菌作用,因此,在选取表面消毒方式时,一定要适宜,不可时间过长,以免对子实体造成伤害.不产生菌丝。
3.2讨论
    目前国内有关北虫草的研究很多,但多为分类、品种资源分布方面的工作,栽培生产方面的研究报道尚少,对此菌的生物学特性、遗传特性等尚未尽悉搞清。在组织分离获取菌种的实验中发现,在子实体有龟背状花纹的顶端切取组织,获得的菌种种性优,产量高。北虫草菌种转管次数增多,子实体产量下降,生产上菌种转管次数不宜超过3次。
 

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